Cy5偶联试剂盒，荧光试剂盒的使用说明书（含图）
Cy5偶联试剂盒，荧光试剂盒的使用说明书
一、简介
Cy5偶联试剂盒可以通过抗体/蛋白上的伯胺基团（如赖氨酸），简单、快速地实现抗体/蛋白与 Cy5的共价偶联。此为通用型试剂盒，适合各种分子量不一致的抗体/蛋白偶联Cy5。偶联在30 分钟内即可完成，偶联效率可达80%左右。纯化使用超滤管快速去除多余Cy5，且不会损失抗体/蛋白。
试剂盒组成 | 数量 | 保存温度 |
Cy5 mix (含10 % Cy5) | 100 mg | -20 ℃ |
Coupling Reagent | 10 mL | -20 ℃ |
Cy5 mix溶解液 | ||
超滤管 (3.5kD) | 2 支 | 室温 |
二、实验步骤
1. 取1~10 mg抗体/蛋白溶解于1 mL纯水中，加入100 μL Coupling Reagent，混合均匀。
(以下步骤按标记1 mg抗体/蛋白为例)
2. 根据Cy5标记需求量，称取 0.1 ~1 mg Cy5 mix固体加至第1步溶液，充分混合溶解。
注：(a) 若Cy5 mix用量超出1 mg，可能导致荧光标记过量，引起荧光部分淬灭;
(b) 若低于1mg的Cy5 mix难以称取，可先取1 mg Cy5 mix固体溶解于100 μL Cy5 mix溶解液，再按需取Cy5 mix溶液加至第1步溶液。由于Cy5 mix溶解后易分解，溶液须尽快使用且不可保存。
3. 室温避光反应30 min，延长反应时间不影响偶联效率。
4. 将反应液转移至超滤管，10000 rpm超滤5 min，即可除去未反应的Cy5和无机盐成分，为提高纯度，可加入纯水重悬抗体/蛋白，重复超滤1~2次。
5. 使用PBS将超滤管截留下的抗体/蛋白重悬，即得到Cy5标记的抗体/蛋白溶液。
三、注意事项
1. 偶联前抗体/蛋白中可能含有成分，建议低于以下比例:
组分 | 建议比例 |
甘油 | < 50% |
叠氮化钠 | < 0.1% |
含氨基的缓冲液（如Tris） | 0 |
pH | 7.0-8.5 |
伯胺（如氨基酸、乙醇胺等） | 0 |
硫醇（如巯基乙醇、 DTT等） | 0 |
2. 偶联后的抗体/蛋白应避光保存。通常在4℃下可保存6~12个月。如需保存更长时间，可加入冷冻保护剂如50%甘油，在-20℃保存。