HBVpreS1多肽(2-21 Aa)介导肝脏靶向纳米脂质体递送系统的研究

HBVpreS1多肽(2-21 Aa)介导肝脏靶向纳米脂质体递送系统的研究

摘要：

研究背景: 

肝脏是人体能量转换,消化,排泄,免疫和解毒等过程的重要器官.肝脏疾病是临床常见的多发病,病毒性肝炎,肝纤维化,肝硬化以及原发性肝癌等极大地影响着人类的健康.我国是肝病的重灾区,约有1.2亿乙肝病毒携带者和1000万例丙肝感染者,有研究表明近80%的原发性肝癌都是由病毒性肝炎引起[1].目前临床肝病的治疗手段包括外科手术,肝移植术和药物治疗等[2].药物作为重要的治疗策略,其目的主要是到达病变部位,清除致病因子,修复受损的肝细胞.然而目前大多数肝病治疗药物由于肝脏分布少,药代动力学性质差,毒副作用大等缺点,应用受到了很大的限制.因此,探索肝病治疗的有效方法和策略是目前亟需解决的重大难题[3]. 肝靶向给药系统(Hepatic targeted drug delivery systems, HTDDS)是一种可以缓释和控释药物的新型策略,能够将药物有效地递送到肝脏的病变部位,发挥药物的治疗效果,降低毒副作用,减少给药次数和用药量,提高了药物的治疗指数,局部浓度和治疗效果,对肝病的治疗具有积极的推动作用,是近年来肝病靶向治疗领域研究的热门[4].HTDDS可分为主动型和被动型两种,被动型一般是采用生物相容性好,毒性低的聚合材料装载药物,利用体循环代谢中的"增强渗透保留"效应(Enhancedpermeation and retention effect, EPR)和肝脏网状内皮系统的吞噬摄取作用发挥靶向传递的功能.主动型是对载体进行一定的靶向修饰,定向地将药物传递到特定的组织和细胞,常见的模式是利用配体-受体或抗原-抗体的特异性结合发挥作用. 

研究内容: 

随着对肝脏组织结构认识地加深,人类不断发现肝脏细胞新的靶点,为肝病的靶向治疗提供了更多新的作用位点.运用质谱分析加双重亲和纯化的技术,我国科学家成功揭示了钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(Sodium Taurocholate CotransportingPolypeptide, NTCP)是HBV和HDV的功能性受体,所用的靶向探针是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)表面抗原PreS1中的一段多肽[5]. HBV是嗜肝类DNA毒科中的一员,其外膜蛋白的preS1段在HBV与肝细胞特异性结合中必不可少,其中与肝细胞特异性结合位点位于第2-48氨基酸肽段中.文献报道:进行乙酰化和豆蔻酰化修饰的pre-S1特殊肽段可成功阻断HBV对人类原代肝细胞(primary human hepatocytes,PHH),树鼩原代肝细胞(primary tupaia hepatocytes,PTH)和经过诱导分化的HepRG细胞的感染.HBVpreS1的第9-21位氨基酸是具有结合阻断能力的高度保守序列,豆蔻酰化修饰的HBVpreS1/2-21myr是有效阻断抑制的*短多肽,其序列为myr-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP-NH2.这提示我们HBVpreS1是与肝细胞表面受体NTCP特异性结合的配体序列,利用其受体与配体特异性结合作用,可以设计出HBVpreS1/2-21myr介导,肝细胞表面NTCP受体靶向的新型肝靶向给药系统. 

研究方法: 

课题的总体设计为以HBVpreS1/2-21myr为靶向介质,以长效循环脂质体(longcirculating liposomes,LCL)为药物载体,荧光素钠(Fluorescein Sodium,FS)作为荧光模式评价药物,采用乙醇注入法制备肝细胞NTCP受体靶向的新型药物递送系统HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL. 首先,采用微波多肽固相合成法合成HBVpreS1多肽(2-21Aa),序列为NH2-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP-COOH,利用高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography,HPLC),质谱(Mass Spectrometry,MS)和离子肼质谱(Ion Trap MassSpectrometry,ITMS)对多肽产物进行表征,进一步进行乙酰化和豆蔻酰化修饰得到多肽HBVpreS1/2-21myr.然后分别进行异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光标记和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000-Mal)的磷脂基团修饰,荧光标记的多肽HBVpreS1/2-21myr-FITC用于多肽靶向性的验证,磷脂基团修饰的多肽产物HBVpreS1/2-21myr-PEG2000-DSPE,将作为脂质体合成的原料与大豆磷脂,胆固醇等脂质体配方成分混合一起,加热并制备脂质体. 其次,制备的荧光素钠靶向脂质体HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL和普通脂质体FS-LCL运用透射电子显微镜(Transimission electron microscope,TEM)观察纳米脂质体的超微形态结构,激光粒度仪测量脂质体粒径大小和分布,HPLC检测脂质体的包封率,并对高压均质机处理的影响和脂质体稳定性做了进一步的研究.此外,通过RT-PCR和质粒转染的方法构建能够稳定表达NTCP的HepG2-NTCP,LO2-NTCP和HEK293-NTCP细胞,原代肝细胞活体分离的方法获得树鼩原代肝细胞和大鼠原代肝细胞.这些细胞将作为体外细胞靶向评价模型分析荧光多肽HBVpreS1/2-21myr-FITC和荧光素钠靶向脂质体HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL的肝脏靶向性.将荧光多肽HBVpreS1/2-21myr-FITC与上述细胞模型孵育培养,以流式细胞术和共聚焦显微镜进行观察和检测,RT-PCR的方法检测转染的细胞中NTCP的表达,从蛋白水平和mRNA水平验证细胞模型构建成功. 最后,将包裹有荧光素钠的靶向纳米脂质体HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL,对照的普通脂质体组FS-LCL和荧光素钠水溶液FS,分别与上述细胞进行孵育培养,以流式细胞技术和激光共聚焦显微镜分析纳米脂质体的肝靶向性. 

研究结果: 

(1)固相法合成的HBVpreS1多肽(2-21Aa)纯度较高,合成工艺简单,操作方便,合成效率高;高效液相色谱,质谱和离子肼质谱表征结果提示合成的多肽产物与设计的多肽序列GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP分子量大小一致,序列吻合; 

(2)成功进行了FITC的荧光标记和DSPE-PEG2000-Mal的磷脂基团修饰; (3)荧光标记的多肽HBVpreS1/2-21myr-FITC具有肝细胞NTCP受体靶向性; (4)制备的荧光素钠靶向纳米脂质体HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL粒径大小合适,平均值为(94.09±9.2) nm;脂质体包封率较高为(89.32±1.02)%;制备工艺操作方便,简单高效,稳定性好; (5)构建的HepG2-NTCP,LO2-NTCP,HEK293-NTCP细胞和活体分离培养的树鼩原代肝细胞可作为HBVpreS1/2-21myr和HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL的体外靶向评价模型; (6)制备的荧光素钠靶向纳米脂质体HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL具有肝细胞NTCP受体靶向性. 研究结论: 通过本实验,我们证实了HBVpreS1/2-21myr与表达有NTCP的HepG2-NTCP,LO2-NTCP和HEK293-NTCP细胞,以及树鼩的原代肝细胞有明显地特异性结合,HBVpreS1/2-21myr修饰的纳米脂质体HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL与对照组相比,通过NTCP与HBVpreS1的受体-配体结合作用,可以高效地递送更多的荧光素钠进入细胞,实现靶向药物传递系统的靶向递送功能,可以做为肝脏靶向给药新策略,为肝病的特异性治疗提供了新的途径和方法.

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