基于两性离子载体材料的小干扰RNA药物输递体系的研究

基于两性离子载体材料的小干扰RNA药物输递体系的研究

作者：李燕

摘要：

小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)药物在疾病治疗中具有广泛的应用前景,但是,siRNA药物的自身缺点是其临床应用的挑战.

目前,常采用PEG修饰的阳离子脂质体进行siRNA药物的递送治疗,以克服siRNA药物治疗中的细胞外和细胞内障碍.然而,PEG修饰严重影响阳离子脂质体对siRNA药物的包埋,降低了阳离子脂质体/siRNA复合物(Lipoplexes)的细胞内吞及内涵体逃逸能力.同时,PEG修饰会引发"加快血液清除"(Accelerated blood clearance,ABC)的免疫反应,严重影响siRNA药物在靶部位的富集和治疗效果.针对以上难题,本文设计了基于两性离子聚合物聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(Poly(carboxybetaine),PCB)的阳离子脂质体siRNA药物输递体系,通过体外和体内实验证明所构建的PCB修饰阳离子脂质体siRNA药物输递体系可以有效地递送siRNA药物至靶细胞,显著提高了siRNA药物的作用效果.论文具体开展的研究工作如下:

 (1)设计合成了PCB修饰的脂质分子二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly(carboxybetaine)n,DSPE-PCBn),用于构建新型长循环阳离子脂质体.其中,DSPE-PCB20在生理条件下可以有效抵抗负电荷蛋白质对阳离子脂质体/siRNA复合物的非特异性吸附,增强阳离子脂质体/siRNA复合物的血清稳定性,效果与DSPE-PEG 2000相当.同时,由于PCB独特的结构:一方面PCB分子中含有大量的正电荷季胺基团,其对阳离子脂质体复合siRNA药物的能力影响小;另一方面PCB分子中含有大量的负电荷羧酸根基团,其在内涵体的酸性条件下可以质子化,增加了阳离子脂质体表面的正电荷,促进阳离子脂质体对负电荷内涵体膜的扰动,从而有利于siRNA药物逃离内涵体进入细胞质发挥基因沉默作用.DSPE-PCB20阳离子脂质体因具有显著的血清稳定性,siRNA药物复合能力和内涵体逃逸能力,其负载针对肝部载脂蛋白B(Apolipoprotein B,ApoB)的siRNA药物ApoB siRNA可以有效下调ApoB的表达,从而降低了血液中胆固醇的含量,在治疗高胆固醇血症方面具有很好的应用前景. 

(2)制备了DSPE-PCB20修饰的新型长循环阳离子脂质体,考察尾静脉注射DSPE-PCB20修饰阳离子脂质体/siRNA复合物是否可以避免ABC现象.DSPE-PEG 2000修饰的阳离子脂质体/siRNA复合物第一次给药会刺激脾脏产生抗PEG-IgM,导致第二次注射的PEG复合物血液清除速率加快,肝脏富集增多,约为第一次富集量的1.5倍.同时,ABC现象严重减少了第二次给药DSPE-PEG 2000阳离子脂质体/siRNA复合物在肿瘤组织的富集.相比,DSPE-PCB20阳离子脂质体/siRNA复合物可以有效避免ABC现象,其两次给药血液清除速率一致,无第二次给药肝脏富集增多的现象产生,从而不影响第二次给药的siRNA药物在肿瘤组织的富集,是同次给药DSPE-PEG 2000组的1.3倍.在细胞水平,PCB修饰可以有效促进siRNA药物的内涵体逃逸能力,使siRNA药物进入细胞质发挥药效.因此,在肿瘤治疗方面,DSPE-PCB20阳离子脂质体负载针对Polo样激酶1(Polo-like kinase 1,Plk1)的siRNA药物siPlk1可以有效沉默目标蛋白Plk1的表达,诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤生长,在肿瘤治疗中具有很好的应用前景.

 (3)设计合成了PCB修饰的喜树碱(Camptothecin,CPT)前药类脂质分子CPT-PCBn,用于制备双重敏感程序可控释放的阳离子脂质体siRNA药物和CPT化疗药物的联合给药输递体系.实验首先通过酯键连接制备了PCB修饰的CPT前药类脂质分子CPT-PCBn,结合阳离子脂质DDAB,制备CPT-PCBn前药阳离子脂质体siRNA药物输递体系.CPT-PCBn前药阳离子脂质体/siRNA复合物不仅提高了药物的稳定性和载药率,同时具有双重敏感程序可控释放的性质.首先,PCB分子在内涵体酸性条件下质子化,增加CPT-PCBn前药阳离子脂质体/siRNA复合物表面正电位,促进对内涵体膜的扰动,从而加快siRNA药物的内涵体逃逸,使其在与细胞孵育4 h时高效释放进入细胞质.其次,CPT-PCBn的酯键连接基团具有酸性和酯酶敏感性,在细胞内涵体和细胞质中利用酸性或酯酶响应断裂,12 h时持续释放CPT进入细胞核.由于siPlk1首先释放下调Plk1蛋白的表达可以促进Hela肿瘤细胞对CPT的敏感性,因此,CPT-PCBn前药阳离子脂质体/siPlk1复合物在体外和体内均具有很好的协同肿瘤抑制效果,在肿瘤治疗中具有很好的应用前景.收起

关键词：小干扰RNA 聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯 阳离子脂质体 内涵体逃逸 加快血液清除现象

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