Janelia Fluor 549 SE，Janelia Fluor 549琥珀酰亚胺酯的偶联特性与光学性能

Janelia Fluor 549 SE（Janelia Fluor 549琥珀酰亚胺酯），别名JF549‑NHS、Janelia Fluor 549‑succinimidyl ester、JF549 SE，属于Janelia Fluor系列近红橙荧光活性酯染料，带有NHS琥珀酰亚胺酯活性基团，专门用于氨基的共价标记，凭借优异的光稳定性、适中的荧光量子产率，在蛋白标记、抗体修饰、生物大分子荧光改性方向得到大量应用。该染料*大激发波长549 nm，*大发射波长处于570 nm附近，光谱区间避开部分生物样本自发荧光区域，能够有效降低样本背景荧光干扰，提升信号信噪比。

NHS琥珀酰亚胺酯官能团是分子的反应核心，可在弱碱性缓冲环境下，与蛋白、多肽表面伯氨基发生酰胺化反应，完成荧光基团共价接枝。反应缓冲体系优先选用无氨基的碳酸盐、硼酸盐缓冲液，体系内不要加入Tris、甘氨酸等含游离氨基组分，这类物质会和目标生物大分子竞争消耗染料，大幅降低标记效率。染料本身在水环境中会发生水解，水解产物丧失偶联活性，因此粉末状态需要避光低温储存，工作液建议使用无水有机溶剂现配现用。

对比传统罗丹明类染料，Janelia Fluor 549 SE经过母核化学修饰，改善了染料分子的疏水性，一定程度减少染料分子在生物样本中非特异性聚集，降低染料团聚带来的荧光淬灭现象。染料标记摩尔比需要合理调控，染料投料过高，容易造成蛋白分子过度标记，改变蛋白空间构象，造成蛋白变性；投料过低，标记产物荧光信号不足，无法满足检测需求，实验中需要通过投料比例摸索适配的标记摩尔比。

标记完成之后，需要通过凝胶过滤、透析等纯化手段，去除未反应游离染料以及水解副产物。游离染料残留会带来很强背景荧光，干扰后续成像与检测结果。该染料适配多种荧光检测设备，兼容共聚焦荧光显微镜、荧光分光光度计、流式检测设备。除标记蛋白多肽之外，该活性酯染料也可用于氨基修饰固相微球、高分子材料的荧光功能化，为固相材料引入荧光读出信号，拓展固相材料的分析用途。染料母核结构也为后续衍生开发提供基础，可基于该荧光骨架合成炔基、叠氮、马来酰亚胺等不同官能团衍生物，适配更多偶联化学体系。

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