乳铁蛋白修饰党参多糖脂质体的制备及抗炎作用的初步研究

乳铁蛋白修饰党参多糖脂质体的制备及抗炎作用的初步研究

作者：安子璇

摘要：

植物多糖因其高效低毒,成为食疗保健品的研发热点,党参多糖(Codonopsis pilosulapolys accharide,CPPS)作为补益药党参的主要活性成分,以往研究证实其具有增强免疫,抗衰老,抗炎,抗氧化等多种药理活性.但与其他多糖类似,水溶液制剂都存在不稳定,易分解,半衰期短,不易透过血脑屏障等问题,限制了其进一步开发.脂质体作为新型药物载体应用广泛,使用脂质体包封的药物稳定性良好,可延长药物在体内的存留时间,提高生物利用度且具有缓释效果,能有效解决多糖制剂的上述问题.有研究发现,多种中枢神经系统退行性疾病发生时,神经细胞和血脑屏障的重要组成细胞之一—脑微血管内皮细胞过度表达乳铁蛋白受体(Lactoferrinreceptor,Lf R),在脂质体表面修饰乳铁蛋白(Lactoferrin,Lf),增加Lf R介导的药物摄取或内吞作用,可使其具有脑靶向性.因此,本实验设想用乳铁蛋白修饰党参多糖脂质体,以提高药物稳定性,延长药物的作用时间,提高其对血脑屏障的透过性.

神经炎症是多种中枢退行性疾病发生和发展的重要机制之一,而小胶质细胞作为中枢神经系统主要的免疫效应细胞,介导中枢神经系统损伤和疾病的内源性免疫反应,对脑内微环境的调节和炎症因子的调控都发挥重要作用.TOLL样受体-4(Toll-like receptor 4,TLR-4)主要表达于小胶质细胞,髓样分化因子-88(myeloid differentiation factor88,My D-88)是TLRs下游的衔接蛋白,可促进转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)激活,进入细胞核.脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的特征成分,可与小胶质细胞膜上的TLR-4结合,进而启动TLR-4/NF-κB信号通路,NF-κB的激活最终会导致活性氧和多种炎症因子的产生.有研究表明,党参均一多糖组分的抗炎活性可能与通过抑制TLR-4/NF-κB途径的活化,进而抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),炎症因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的释放有关.因此,本实验通过LPS诱导BV2细胞建立体外炎症细胞模型,观察CPPS及其脂质体新剂型的抗炎作用,初步探讨其抗炎机制.本研究基于课题组前期对CPPS改善学习记忆,抗炎,抗氧化等药理作用的研究,对其进行剂型改进.实验首先将一定比例的大豆卵磷脂,胆固醇,吐温-80溶于氯仿,通过逆向蒸发法制备党参多糖脂质体(CPPS-Lips),并通过单因素考察和星点设计-响应面法对制备工艺进行优化;再通过DSPE-PEG2000-COOH上的活性末端羧基将乳铁蛋白与CPPS-Lips连接,制得乳铁蛋白修饰的党参多糖脂质体(Lf-CPPS-LCL).然后通过粒径,电位测定,透射电镜观察,以及体外释放,红外光谱分析对新剂型进行理化性质考察.通过人脐静脉内皮细胞(Huvecs)与大鼠脑胶质瘤细胞(C6)共培养构建非接触体外血脑屏障模型,通过4h渗漏实验和跨内皮细胞电阻抗(transendothelial electrical resistance,TEER)对模型进行评价并应用此模型观察CPPS,CPPS-Lips,Lf-CPPS-LCL的血脑屏障透过性.通过LPS诱导BV2细胞构建体外炎症细胞模型,通过细胞存活率和NO释放量测定,评价CPPS,CPPS-Lips,Lf-CPPS-LCL对炎症细胞模型的影响;并利用酶联免疫法(ELISA)检测TNF-α,IL-1β,IL-6炎症因子的释放,利用蛋白免疫印迹法观察TLR-4/My D-88/NF-κB信号通路相关蛋白的表达,从细胞和分子水平初步探讨CPPS,CPPS-Lips,Lf-CPPS-LCL的抗炎作用机制.实验的主要结果如下:首先,制备CPPS-Lips时,先对pH值,膜材比,脂药比,超声时间等进行单因素考察,再以实验结果为依据,选择卵磷脂与胆固醇的比,脂药比,超声时间3个因素,每个因素设3个水平,进行响应曲面法优化,最终确定制备CPPS-Lips的最优处方条件为超声时间25min,胆固醇35.4mg,党参多糖6.47mg,预测包封率为73.64%,经重复验证,实测值与预测值的误差均小于5%,实验预测性较好.然后,将5%浓度的DSPE-PEG2000加入到采用最佳优化处方制备的CPPS-Lips中,60℃水浴搅拌孵育1h,得到CPPS-LCL;再按照EDC:NHS:DSPE-PEG2000-COOH以10:10:1(mo L/mo L)的比例加入CPPS-LCL中,室温搅拌10min,对CPPS-LCL进行活化;再将Lf按照Lf:DSPE-PEG2000-COOH以1:4(mo L/mo L)的比例加入活化后的CPPS-LCL中,37℃水浴孵育3h;再加入到截留分子量为10KDa的处理过的透析袋中,透析22h,除去游离的CPPS,Lf,催化剂,最终得到纯化的Lf-CPPS-LCL.透射电镜观察可见,制得的CPPS-Lips,Lf-CPPS-LCL外观呈球形,形态较圆整,大小均一;马尔文粒度仪测得CPPS-Lips的平均粒径为151.20±2.18nm,PDI为0.23±0.03,分布良好,电位平均值为-17.74±0.62m V.Lf-CPPS-LCL的平均粒径为197.50±0.62nm,PDI为0.19±0.02,电位平均值为-18.80士1.12m V;

红外光谱结果显示:-COOH-的特征吸收峰消失,产生了仲酰胺-CONH-的特征吸收峰,表明Lf上的-NH2-与双功能PEG上的-COOH-成功接枝;体外释放实验结果显示:游离CPPS在10h内基本完全释放,累计释放率为94.84%,CPPS-Lips在36h时累计释放率达到92.67%,CPPS-LCL和Lf-CPPS-LCL在72h时累计释放率分别为75.74%和74.47%,与原料药相比,CPPS-Lips,Lf-CPPS-LCL具有明显的缓释作用.体外模拟血脑屏障细胞实验中,结果显示CPPS和Lf-CPPS-LCL均能透过,同浓度的Lf-CPPS-LCL比CPPS通透性更好.通过细胞活性测定,比较确定以1μg·m L-1LPS诱导24h BV2细胞构建神经炎症的体外细胞模型.实验分为正常对照组,模型组,CPPS,CPPS-Lips和Lf-CPPS-LCL的低,中,高剂量组(1,10,100μg·m L-1).模型组给予1μg·m L-1的LPS;CPPS,CPPS-Lips和Lf-CPPS-LCL的低,中,高剂量组给予1μg·m L-1的LPS诱导培养24h后,分别给予CPPS,CPPS-Lips和Lf-CPPS-LCL(1,10,100μg·m L-1)继续培养24h.然后进行Griess法NO水平检测,结果显示:模型组与正常对照组能显著升高NO释放量(P<0.01),CPPS,CPPS-Lips和Lf-CPPS-LCL低,中,高剂量组与模型组相比能显著降低NO释放量(P<0.05或P<0.01).ELISA实验结果显示,模型组的TNF-α,IL-1β,IL-6含量均显著升高(P<0.01),CPPS,CPPS-Lips和Lf-CPPS-LCL低,中,高剂量组细胞上清液的TNF-α,IL-1β,IL-6与模型组相比显著降低(P<0.05或P<0.01).蛋白免疫印迹实验结果显示,模型组与对照组相比TLR-4,NF-κB,My D-88蛋白相对表达量显著升高(P<0.01);CPPS,CPPS-Lips和Lf-CPPS-LCL低,中,高剂量组与模型组相比蛋白相对表达量显著降低(P<0.05或P<0.01).提示CPPS通过下调TLR-4/My D88/NF-κB通路蛋白的表达,进而对LPS诱导的BV2细胞的TNF-α,IL-1β,IL-6这些炎症因子的释放发挥不同程度的抑制作用.

版权声明：

本平台根据相关科技期刊文献、教材以及网站编译整理的内容，仅用于对相关科学作品的介绍、评论以及课堂教学或科学研究。如有侵权，请联系我们删除。