半乳糖修饰红细胞膜融合脂质体制备及其肝脏靶向性研究
半乳糖修饰红细胞膜融合脂质体制备及其肝脏靶向性研究
作者：孙岩
摘要：
目的
本课题设计合成了肝脏靶向脂链和红细胞膜融合脂质体新型载药系统,并对该新型载体的制剂学性质进行研究.一方面以非诺贝特(Fenofibrate,FNB)作为模型药物,对脂质体制备工艺进行优化,并对载药载体的细胞毒性,脂质沉积肝细胞模型的改善作用和长循环作用进行药效学研究与评价;另一方面以罗丹明B(RhodamineB,RhB)和吲哚菁绿(Indocyaninegreen,ICG)作为荧光标记物,对荧光载体的细胞内靶向性,ICR小鼠体内靶向分布等进行研究为后期肝脏疾病的靶向治疗提供新治疗手段.
方法
(1)半乳糖修饰红细胞膜融合非诺贝特脂质体的制备 以二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇3400(DSPE-PEG3400-NHS)和半乳糖胺为原料,通过NHS活性酯和氨基的酰胺反应,生成的二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-半乳糖-聚乙二醇3400(DSPE-PEG3400-Gal)作为肝脏载药靶向分子;采用核磁共振氢谱(1H-NMR)法确证载药靶向分子的结构;低渗法制备红细胞膜后利用脂质插入原理将肝脏靶向分子连接到红细胞膜上,形成半乳糖修饰红细胞膜(Gal-RBC);采用薄膜水化法制备非诺贝特脂质体(Fenofibrate-Lipsome,FNB-Lip);将连接靶向分子的红细胞膜与脂质体共挤出最后制得半乳糖修饰红细胞膜融合非诺贝特脂质体(Gal-RBC-FNB-Lip);将粒径,聚合物分散性指数(Polymerdispersityindex,PDI)等作为脂质体稳定性的考察指标;透射电镜(TransmissionElectronMicroscope,TEM)对所得的FNB-Lip和Gal-RBC-FNB-Lip脂质体进行形态学表征;采用透析法研究靶向载体的药物释放. (2)载药脂质体FNB-Lip的工艺优化 采用HPLC建立FNB体外分析方法;高速离心法测定脂质体的包封率(Encapsulationefficiency,EE)和载药率(Dragloading,DL);采用响应面法对脂质体制备条件进行优化筛选(DesignExpert8.0软件),得到FNB-Lip最佳制备条件;TEM对优选的FNB-Lip进行表征,考察其包封率,载药量,并将粒径和PDI作为指标考察稳定性. (3)半乳糖修饰红细胞膜融合脂质体的药效学研究 采用HPLC法建立小鼠血浆中的FNB酸的体内分析方法;分别给予小鼠不同浓度的FNB及Gal-RBC-FNB-Lip融合脂质体,通过HPLC法检测血液中FNB酸的含量,考察靶向载体对FNB体内吸收的影响;MTT法测定HL-02细胞给予不同浓度的Gal-RBC-FNB-Lip共培养后的细胞存活率,从而判断其细胞毒性;使用油酸棕榈酸诱导脂质沉积HL-02细胞模型,通过检测细胞上清液中总胆固醇TC,甘油三酯TG水平初步判断Gal-RBC-FNB-Lip和FNB原药对脂质沉积模型的预防给药药效. (4)半乳糖修饰红细胞膜融合脂质体的肝靶向研究 采用RhB被细胞摄取后形成荧光的强度大小验证半乳糖修饰红细胞膜融合罗丹明B脂质体(Gal-RBC-RhB-Lip)相对于RhB和RhB脂质体(RhodamineB-Lipsome,RhB-Lip)对肝细胞的靶向作用;采用小鼠活体成像技术研究ICG作为荧光探针标记的Gal-RBC-ICG-Lip靶向载体在小鼠体内的组织靶向分布情况.
结果
(1)合成的DSPE-PEG3400-Gal为白色无定型粉末,可溶于水中;其1H-NMR显示所得的DSPE-PEG3400-Gal同时具备了半乳糖的特殊质子化学位移峰(3.35ppm)和DSPE的特殊质子化学位移峰(0.92ppm),NHS活性酯的特殊质子化学位移峰(2.75ppm)消失;低渗法制备的红细胞膜为无色膜状;通过TEM可见红细胞膜融合脂质体Gal-RBC-FNB-Lip相较于FNB-Lip,其表面被红细胞膜包覆或者直接和脂质体相融合,其粒径相较于FNB-Lip有一定的增大,但PDI维持在0.26-0.27左右;含2%CremophorEL的PBS溶液介质中,FNB混悬液的48h累积释放度为85.8%,而Gal-RBC-FNB-Lip的48h累积释放度为38.3%. (2)建立了FNB的体外分析方法,使用正交试验考察了脂质体的磷脂浓度,磷脂与胆固醇的比例,磷脂与药物的比例等三个因素对脂质体包封载药率的影响,并且用响应面法筛选出优化制备处方,脂药比为3:1.优化处方制备的FNB-Lip溶液呈乳白色,粒径为87.69±1.94nm,PDI为0.254±0.01;通过TEM检测可见脂质体为类球形,有明显的单层膜结构,长期放置储存对其粒径和PDI无影响. (3)适应性饲养一周后,小鼠灌胃给与浓度为10,20,40mg/kg的FNB和相同剂量的Gal-RBC-FNB-Lip,测定12h后小鼠血液中的FNB酸浓度,测定结果显示,低浓度下血液中Gal-RBC-FNB-Lip组FNB酸浓度为FNB组的8倍左右,且随着浓度升高,该倍数还在继续扩大.FNB组的FNB酸的血液浓度与给药浓度没有明显联系,而Gal-RBC-FNB-Lip组的FNB酸血液浓度与给药浓度有较强的相关性.MTT法结果显示,Gal-RBC-FNB-Lip浓度在1μM以下时细胞存活率在85%以上,与FNB组的细胞存活率并没有显著性差异.脂质沉积模型结果显示,在相同浓度下Gal-RBC-FNB-Lip组与FNB组治疗和预防给药TC和TG水平的下降程度也没有显著性差异,说明本半乳糖修饰红细胞膜融合脂质体载药系统不会对体外细胞造成毒性作用. (4)体外细胞荧光实验显示,单纯RhB在细胞中的摄取荧光强度大于RhB-Lip,而Gal-RBC-RhB-Lip被细胞摄取的荧光强度显著强于前两者(**plt;0.01).小动物活体成像示踪试验显示,ICG组ICG代谢速度最快,ICG-Lip组其次,Gal-RBC-ICG-Lip组ICG代谢*慢.代谢24h后,ICG组在主要器官中几乎ICG无残留,而ICG-Lip组在肝脏,肾脏和脾中的ICG残留明显,肺部也有一点沾染;相对于ICG-Lip组,Gal-RBC-ICG-Lip组的ICG残留都集中于肝脏,肝脏的荧光信号远强于Gal-RBC-ICG-Lip组肾脏以及ICG-Lip组肝脏和肾脏.
结论
(1)用核磁氢谱验证了所得化合物为DSPE-PEG3400-Gal.用TEM对Gal-RBC-FNB-Lip进行了表征,证明红细胞膜与脂质体成功融合,并且Gal-RBC-FNB-Lip与采用优选工艺制备的FNB-Lip的粒径都很均匀,分散程度好,稳定性高.符合脂质体的一般药学制备要求和后续的实验要求. (2)体外释放实验说明Gal-RBC-FNB-Lip能明显延长FNB的释放时间.对于脂质沉积模型,Gal-RBC-FNB-Lip与FNB对TC,TG水平的降低程度没显著性差异,说明FNB的载体化修饰并不会影响FNB本身的降脂效果.FNB酸的稳定血浆药物浓度说明Gal-RBC-FNB-Lip能有效延长FNB在小鼠体内中的释放时间,从而高使FNB酸的高血液浓度维持更长时间,减少药物剂量,减低药物在其他组织器官的吸收和毒副作用.
(3)荧光实验说明,相较于RhB和RhB-Lip组,Gal-RBC-RhB-Lip组载药能更迅速地被肝细胞摄取,对肝细胞有显著的靶向作用.小鼠的活体成像实验结果说明,Gal-RBC-FNB-Lip组不仅明显延长了ICG的代谢时间,而且相对于ICG-Lip和ICG组,Gal-RBC-FNB-Lip组对于小鼠体内肝脏的靶向性更加显著.
关键词：半乳糖修饰 红细胞膜 脂质体 肝脏靶向性 药效学评价
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