4'-AMinoMethyl-5-FAM，4'-氨甲基-5-羧基荧光素的合成与反应机制
1.化学结构与特性
核心结构：基于5-羧基荧光素（5-FAM）母核，在4'位引入氨甲基（-CH₂NH₂），形成羧基（-COOH）和氨基（-NH₂）双反应位点。
荧光特性：绿色荧光（激发/发射波长约492/518 nm），pH依赖性（pH 8-9时荧光最强），光稳定性中等，需避光操作。
物理性质：深紫色固体粉末，溶于DMSO、DMF等有机溶剂，微溶于水；需-20℃以下避光干燥保存，避免反复冻融。
2. 核心应用
核酸标记与测序
作为荧光染料用于DNA/RNA标记、测序及核苷酸检测，如qPCR探针、FISH（荧光原位杂交）技术。
蛋白质标记与追踪
通过羧基或氨基与蛋白质的氨基/羧基共价结合，用于免疫荧光、Western Blot、流式细胞术及活细胞成像（如追踪蛋白质定位、定量分析）。
生物共轭化学
作为连接臂构建荧光标记复合物（如葡聚糖、链霉亲和素、血清白蛋白），支持多步偶联策略（如正交标记：羧基连接靶向分子，氨基连接荧光报告基团）。
细胞成像与微环境监测
用于活细胞/固定细胞的荧光标记，监测细胞内pH、离子浓度及信号传导过程。
3. 合成与反应机制
合成路径：基于5-羧基荧光素，通过化学修饰在4'位引入氨甲基，需纯化以分离5/6-异构体混合物。
反应机制：
羧基活化：经EDC/NHS活化后与氨基反应形成酰胺键。
氨基反应：与羧基、醛基或活性酯（如NHS、磺酰氯）缩合，支持希夫碱反应或点击化学。
4. 安全与储存
储存条件：-20℃以下干燥避光保存，避免反复冻融；使用前需回温至室温并保持干燥。
安全提示：仅用于科研，不可用于人体；操作时需佩戴防护装备（手套、护目镜），避免吸入粉尘；反应需严格控制pH（羧基活化pH 4.5-6.0，氨基反应pH 7.5-9.0）。
纯化要求：反应后需通过HPLC、透析或凝胶过滤去除未反应试剂。
5. 优势与局限
优势：双功能团设计支持灵活偶联策略，高荧光量子产率提升检测灵敏度，生物相容性好。
局限：光稳定性较差，需严格避光；异构体可能影响反应特异性，需纯化；仅适用于科研实验。
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