CAL Fluor Red 610 dT Amidite一种功能化核苷磷酰胺化试剂

CAL Fluor Red 610 dT Amidite 是一种功能化核苷磷酰胺化试剂，用于固相寡核苷酸合成中在胸腺嘧啶（dT）位置引入红色荧光标记。其荧光团 CAL Fluor Red 610 具有激发波长约 590 nm、发射波长约 610 nm 的特性，量子产率高、光稳定性良好，可用于实时定量 PCR（qPCR）、荧光原位杂交（FISH）、分子探针及多通道荧光分析实验。该试剂通过将荧光团与 dT 核苷磷酰胺化结合，既保持核酸杂交能力，也实现标记位置的高度可控。

化学结构特点：CAL Fluor Red 610 dT Amidite 由三部分组成：

1. 胸腺嘧啶核苷骨架：保留天然脱氧核糖和碱基结构，保证链延伸后寡核苷酸的正常杂交与酶识别功能。

2. 磷酰胺化活性端（CE 型）：通过与前一核苷的 5′-羟基偶联，形成可氧化为稳定磷酸酯键的中间体，实现链延伸。

3. CAL Fluor Red 610 荧光团及柔性连接桥：荧光团通过短链烷基或聚醚（如 TEG）连接到 dT 核苷，空间上隔离核酸主链，减少 steric hindrance，提高荧光效率并降低自猝灭。

合成路线主要包括以下步骤：

1. 荧光团活化
   从 CAL Fluor Red 610 酸性前体出发，通过羟基化或酯化反应引入活化位点（如羟基或酰基），为后续磷酰胺化提供反应性官能团。此过程中需控制溶剂、温度和酸碱条件，以保证染料分子稳定。

2. 与胸腺嘧啶衍生物偶联
   将活化的 CAL Fluor Red 610 荧光团与保护性 dT 核苷（通常 5′-DMT 保护）通过柔性连接桥（烷基或 TEG）共价结合，形成荧光标记核苷衍生物。柔性连接桥的引入既保证空间隔离，又维持染料光学特性。

3. 磷酰胺化反应
   将荧光标记 dT 核苷的 3′-羟基通过 2-氰乙基磷酰胺化处理，生成 CAL Fluor Red 610 dT CE-Phosphoramidite。磷酰胺化端为固相寡核苷酸合成提供活性位点，能够与前一个核苷的 5′-羟基高效偶联。

4. 纯化与干燥
   最终产物通过柱层析或高效液相色谱（HPLC）进行纯化，去除副产物和未反应的前体，得到高纯度、干燥且光稳定的 CAL Fluor Red 610 dT Amidite，适合直接用于自动化 DNA/RNA 合成。

总体而言，CAL Fluor Red 610 dT Amidite 通过荧光团活化、与胸腺嘧啶偶联、磷酰胺化以及纯化步骤制备而成。其结构设计兼顾荧光性能、化学稳定性和核酸功能保留，能够高效、可控地将红色荧光标记引入寡核苷酸，用于荧光探针构建、实时定量 PCR 和多通道荧光分析等生物分子研究。