AF514 NHS ester，Alexa Fluor 514 NHS，AF514 琥珀酰亚胺酯的局限性

产品名称：AF514 NHS ester，Alexa Fluor 514 NHS，AF514 琥珀酰亚胺酯的局限性

一、荧光特性相关局限性

光谱范围限制

激发波长518nm，发射波长543nm（绿-黄光范围），与绿光染料（如AF488，520nm发射）存在部分光谱重叠，多色成像时需通过荧光补偿或滤光片优化减少串扰。

斯托克斯位移（约25nm）较小，可能增加激发光与发射光的交叉干扰风险，影响信噪比。

光稳定性与长时间成像

虽光稳定性优于传统染料（如罗丹明6G），但长时间光照仍可能导致光漂白，限制其在活细胞长时间动态追踪（如内吞、膜转运）中的应用。

紫外/蓝光激发可能对细胞产生光毒性，需优化激发光强度和曝光时间。

二、反应条件与标记效率限制

NHS酯反应敏感性

NHS酯在碱性条件（pH 7.5-8.5）下稳定，但酸性或中性环境易水解失效，需严格控制反应pH值，增加操作复杂性。

反应需无水环境（防止水解），与生物分子（如蛋白质、抗体）的伯胺结合时，需避免还原剂（如DTT、β-巯基乙醇）干扰，限制其在还原环境中的应用。

标记效率与特异性

标记效率受生物分子中伯胺位点数量及空间位阻影响，如蛋白质表面赖氨酸残基的分布不均可能导致标记不均匀。

非特异性结合风险：虽NHS酯对伯胺有高特异性，但高浓度或长时间反应可能增加非特异性标记概率，需通过透析或层析纯化去除游离染料。

三、生物相容性与毒性

细胞毒性

虽搜索结果显示生物兼容性好，但高浓度（>10μM）或长期暴露可能对活细胞产生毒性，影响细胞活性或功能，需通过浓度梯度实验优化工作浓度。

标记后可能影响生物分子（如抗体、受体）的活性或构象，需验证标记后分子的功能保留情况。

应用场景限制

主要适用于固定细胞或组织、体外实验，活细胞应用需谨慎控制标记条件（如温度、时间），避免细胞损伤。

在活体成像中，因激发/发射波长处于可见光范围，组织穿透深度有限，可能不适合深层组织成像。

温馨提示：仅用于科研，不能用于人体实验！wyh

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