AF488-dUTP的反应条件

产品名称：AF488-dUTP的反应条件

核心反应条件

缓冲体系

pH与溶剂：推荐使用TE缓冲液（pH 7.5）或PBS，pH范围7.4-7.5，确保DNA聚合酶活性及染料稳定性。

离子需求：需添加Mg²⁺（1.5-2.5 mM）作为DNA聚合酶辅助因子，部分实验需K⁺（50-100 mM）增强酶活性。

温度与时间

常规反应：37℃（如PCR、缺口平移、随机引物标记），反应时间30分钟至数小时（根据实验设计调整）。

特殊应用：如EdU增殖实验中，需结合短时间孵育（5-30分钟）和后续固定/通透步骤。

酶与底物比例

酶种类：常用DNA聚合酶（Taq、Klenow片段）、末端转移酶（TdT）、逆转录酶或随机引物酶。

dUTP比例：建议dTTP:AF488-dUTP为2:1，平衡荧光信号强度与扩增效率，避免高比例抑制酶活性。

荧光特性适配

激发/发射：激发波长495nm，发射波长519nm，需匹配荧光显微镜/流式细胞仪的FITC通道滤光片。

光稳定性：抗光漂白能力优于传统FITC，但需避光操作以减少信号衰减。

优化策略与注意事项

标记效率提升

纯化步骤：反应后需通过乙醇沉淀、色谱法或离心柱（如Sephadex G-25）去除游离染料，降低背景干扰。

比例优化：通过预实验调整dTTP:AF488-dUTP比例（如1:1至4:1），平衡信号强度与扩增效率。

储存与操作规范

储存条件：-20℃避光干燥保存，避免反复冻融；分装为单次使用量以减少降解风险。

操作防护：穿戴实验服、手套，避免直接接触皮肤或吸入；操作时使用锡纸包裹容器避光。

应用场景适配

PCR/FISH：用于制备荧光标记探针，需确保引物设计兼容dUTP掺入，避免二级结构干扰。

流式细胞术：需优化抗体-染料偶联物的浓度（通常1-5μg/mL），结合生物素-链霉亲和素系统增强信号。

多色成像：与iFluor 555/647等染料联用时，需通过荧光补偿减少光谱重叠。

问题排查

信号弱：检查酶活性、dUTP比例、反应时间；确认荧光滤光片匹配性。

非特异性标记：增加洗涤次数，使用低荧光背景缓冲液；优化封闭步骤（如BSA）减少非特异性吸附。

酶抑制：避免高浓度dUTP（>50μM），必要时增加酶量或延长反应时间。

温馨提示：仅用于科研，不能用于人体实验！wyh

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