ATTO 647 Maleimide，AT 647 Mal，ATTO 647马来酰亚胺的实验设计优化

产品名称：ATTO 647 Maleimide，AT 647 Mal，ATTO 647马来酰亚胺的实验设计优化

一、反应条件优化：精准调控反应参数

pH与缓冲体系

最佳反应pH为6.5-7.5（如PBS、HEPES缓冲液），此条件下巯基（-SH）去质子化程度适中，与马来酰亚胺基团形成稳定硫醚键，避免酸性（pH<6）导致巯基质子化失活或碱性（pH>8）引发水解副反应。

禁用含游离巯基（如DTT、β-巯基乙醇）或氨基（如Tris、甘氨酸）的缓冲液，防止竞争反应；可添加0.1-0.5 mM EDTA螯合金属离子，减少氧化干扰。

温度与时间

室温（20-25℃）下反应30-60分钟为标准流程，低温（4℃）可延长至2-4小时以减少非特异性结合，避免高温（>37℃）引发蛋白变性或染料降解。

动态追踪场景（如活细胞成像）需控制反应时间≤30分钟，减少细胞损伤。

溶剂与浓度

染料溶于无水DMSO/DMF（浓度1-5 mM），添加比例≤5%防蛋白变性；目标分子（如抗体、蛋白）浓度建议≥1 mg/mL，过低浓度降低标记效率，过高浓度易导致聚集。

二、标记效率提升：多策略协同优化

摩尔比控制

染料与目标分子摩尔比通常为2-5:1（如抗体标记），通过紫外光谱法（A280蛋白吸收与ATTO 647特征峰A647吸光度）计算F/P值（每摩尔蛋白结合染料摩尔数），确保标记密度适中（避免过度标记导致蛋白活性丧失或聚集）。

纯化与封闭

反应后通过凝胶过滤（Sephadex G-25）、超滤管（10-30 kDa分子量截留）或透析去除游离染料及副产物，降低背景信号；使用N-乙基马来酰亚胺（NEM）封闭未反应的巯基，减少非特异性结合。

抗淬灭与稳定性增强

添加抗淬灭剂（如抗坏血酸、ProClin 300）提升荧光稳定性；标记后样品需避光存储（-20℃或4℃），避免反复冻融导致染料降解。

三、生物相容性与安全性管理

细胞毒性控制

低毒性，适用于活细胞成像（如细胞膜标记、内吞途径追踪），需通过MTT/CCK-8实验验证标记后细胞活性无显著下降；控制紫外光曝光时间（<50ms/帧），减少光损伤。

生物活性验证

通过功能实验（如酶活性测定、细胞结合实验、ELISA）确认标记后蛋白/抗体的生物活性保留；例如，标记抗体需验证其与抗原的结合能力，确保实验准确性。

储存与操作规范

染料需-20℃避光干燥保存，避免反复冻融；操作时佩戴手套、护目镜，废液按实验室危险废物处理，防环境污染；避免与强氧化剂接触，防爆炸风险。

温馨提示：仅用于科研，不能用于人体实验！wyh

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