HA-FITC，Hyaluronate FITC，透明质酸-荧光素的荧光标记过程

产品名称：HA-FITC，Hyaluronate FITC，透明质酸-荧光素的荧光标记过程

一、标记前预处理：原料活化与体系准备

原料选择与预处理：

透明质酸（HA）：选用分子量 5k-200k Da 的 HA，需提前真空干燥（60℃，24h）去除水分，避免水分影响羧基活化效率；若 HA 纯度较低，需通过透析（MWCO 3.5k Da）或凝胶过滤色谱纯化，去除杂质蛋白与小分子污染物。

荧光素（FITC）：选择 FITC-Isothiocyanate（异硫氰酸荧光素），其异硫氰酸酯基团（-NCS）与氨基反应活性更高，荧光量子产率稳定（Φ=0.79），且在水溶液中荧光特性优异。

溶剂体系：采用碱性缓冲液（pH 8.5-9.0） 如碳酸盐 - 碳酸氢盐缓冲液、Tris-HCl 缓冲液，既能维持 FITC 稳定性，又能促进 HA 羧基去质子化（-COOH → -COO⁻），提升反应活性；避免使用含氨基的缓冲液（如 PBS），防止竞争性反应。

HA 羧基活化（关键步骤）：

向 HA 的缓冲液溶液中加入活化剂，常用组合为1 - 乙基 - 3-（3 - 二甲胺丙基）碳二亚胺（EDC・HCl）+ N - 羟基琥珀酰亚胺（NHS），摩尔比为 HA-COOH : EDC : NHS = 1 : 1.2 : 1.5。

室温搅拌活化 15-30min，使 HA 的羧基转化为活泼酯中间体（-CO-NHS），该中间体可与 FITC 的氨基快速发生酰胺化反应，显著提升偶联效率（相比直接反应效率提升 3-5 倍）。

活化过程需避光操作，避免 FITC 提前光降解。

二、荧光偶联反应：特异性酰胺化与反应控制

投料与反应：

将 FITC 的 DMF 溶液（浓度 10mg/mL）缓慢滴加入活化后的 HA 溶液中，FITC 与 HA-COOH 的摩尔比控制在 0.1-0.5 : 1（根据所需标记率调整，常用标记率 5%-20%），滴加过程中持续搅拌，避免局部浓度过高导致 FITC 聚集。

室温下避光搅拌反应 4-8h，或 4℃冷藏反应 12-24h，确保反应充分；反应过程中可通过紫外分光光度法（监测 FITC 在 495nm 处的特征吸收峰变化）实时追踪偶联进度。

反应机制：

FITC 的异硫氰酸酯基团（-NCS）与 HA 羧基活化后形成的活泼酯发生亲核取代反应，FITC 的氨基（-NH-）与 HA 的羧基通过酰胺键（-CO-NH-） 共价连接，生成 HA-FITC 偶联物；同时释放 NHS 与副产物，反应式如下：

HA-CO-NHS + FITC-NCS → HA-CO-NH-FITC + NHS

碱性条件（pH 8.5-9.0）可促进 FITC 的 - NCS 基团亲核反应活性，同时避免 HA 发生降解，保障偶联物结构完整性。

温馨提示：仅用于科研，不能用于人体实验！wyh

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