AF750 琥珀酰亚胺酯，Alexa Fluor750 NHS Ester，AF750 SE的标记效率

产品名称：AF750 琥珀酰亚胺酯，Alexa Fluor750 NHS Ester，AF750 SE的标记效率

一、反应条件优化：核心参数调控

pH值：最佳反应pH为8.3-9.0（如0.1-0.2 M碳酸氢钠缓冲液），此条件下氨基（如赖氨酸ε-氨基）质子化程度低，与NHS酯反应活性最高。酸性或强碱性环境需预先通过透析/超滤调整pH至中性范围。

温度与时间：室温（20-25℃）下反应1小时为标准流程，升高温度可加速反应但需避免蛋白变性；延长反应时间（如2小时）可提升标记率，但需平衡光漂白风险。

溶剂与浓度：染料溶于无水DMSO/DMF（浓度10-20 mM），避免水解；蛋白浓度建议≥2 mg/mL，过低浓度（如<1 mg/mL）显著降低效率，可通过超滤浓缩提升浓度。

缓冲液成分：禁用含游离胺（Tris、甘氨酸）或硫醇的缓冲液，需透析去除铵盐（如硫酸铵），避免竞争反应。

二、标记比例（DOL）控制：精准调控策略

摩尔比优化：染料与蛋白摩尔比通常为2-6:1（如抗体标记DOL 2-6），通过预实验确定最佳比例。过高比例可能导致蛋白聚集或活性丧失，过低则信号不足。

标记比例计算：采用紫外-可见光谱法，通过蛋白（A280）与染料特征峰（如AF750 A750）吸光度计算F/P值（每摩尔蛋白结合染料摩尔数）。

纯化验证：反应后通过凝胶过滤（Sephadex G-25）、超滤管或专用纯化试剂盒（如针对50-100 μg抗体的试剂盒）去除游离染料，确保标记物纯度。

三、效率测定方法：多维度验证

光谱法：通过比色皿测定标记前后蛋白与染料的吸光度，结合摩尔消光系数计算标记效率，是量化标记程度的标准方法。

电泳法：SDS-PAGE电泳观察荧光条带迁移，确认标记成功及蛋白完整性；Western blot可进一步验证特异性。

成像法：共聚焦显微镜/流式细胞术检测荧光信号强度与分布，评估标记物的生物活性及靶向性。

功能验证：通过免疫检测（如ELISA）、细胞结合实验等验证标记后蛋白的生物学功能是否保留。

四、影响因素与注意事项：关键风险点

蛋白特性：不同蛋白的氨基含量、等电点及稳定性影响标记效率。如抗体需避免稳定蛋白（BSA）干扰，需预先纯化。

储存与操作：染料需-20℃避光干燥保存，避免反复冻融；操作时需避光、戴手套，防止光漂白及毒性接触。

干扰物质：叠氮化钠、硫柳汞需通过透析/超滤去除；避免与强还原剂接触，防爆炸风险。

实验设计：多色标记需荧光补偿校正；活细胞成像需控制紫外光剂量，减少细胞损伤。

温馨提示：仅用于科研，不能用于人体实验！wyh

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