AF594 NH2，AF594 氨基，AF594 amine的影响因素

产品名称：AF594 NH2，AF594 氨基，AF594 amine的影响因素

一、反应机制与化学特性

反应基团活性：AF594氨基通常以伯胺（-NH₂）形式存在，可与活化羧酸（如NHS酯、EDC/NHS体系）、醛基（Schiff碱反应后需还原）、环氧基等发生共价反应，形成稳定酰胺键或C-N键。反应活性受氨基质子化状态（pH依赖）、空间位阻及电子效应影响。

标记比例（DOL）控制：通过调节染料与目标分子（如蛋白、抗体）的摩尔比（通常2-10:1），结合紫外光谱法（A280蛋白吸收与AF594特征峰A590吸光度计算F/P值）精准控制标记密度，避免过高DOL导致蛋白聚集或活性丧失。

二、环境条件优化

pH值：最佳反应pH为7.5-9.0（如碳酸氢钠缓冲液）。酸性环境（pH<7）抑制氨基去质子化，降低反应活性；强碱性环境（pH>10）可能引发水解或副反应。

温度与时间：室温（20-25℃）下反应1-2小时为标准流程，升高温度（37℃）可加速反应但需避免蛋白变性；低温（4℃）延长反应时间可提升标记率但需平衡光漂白风险。

溶剂与浓度：染料溶于无水DMSO/DMF（浓度10-20 mM），避免水解；目标分子浓度建议≥1 mg/mL，过低浓度降低碰撞频率，影响效率。

缓冲液成分：禁用含游离胺（Tris、甘氨酸）、硫醇或金属离子的缓冲液，需透析去除铵盐（如硫酸铵），避免竞争反应。

三、分子特性与生物相容性

目标分子特性：蛋白质的氨基含量（如赖氨酸ε-氨基）、等电点（pI）、稳定性及糖基化程度影响标记效率。例如，抗体需预先纯化去除稳定剂（如BSA），避免非特异性结合。

荧光稳定性：AF594量子产率（约0.9）高，光稳定性优于传统染料（如TRITC），但需避光操作防止光漂白；抗淬灭剂（如抗坏血酸）可提升成像稳定性。

生物相容性：标记后需验证生物分子活性（如抗体结合能力、酶活性），通过功能实验（如ELISA、细胞结合试验）确认无显著影响。

四、操作规范与纯化方法

纯化步骤：反应后通过凝胶过滤（Sephadex G-25）、超滤管或亲和层析去除游离染料及副产物，确保标记物纯度，降低背景信号。

储存条件：染料需-20℃避光干燥保存，避免反复冻融；标记后样品需分装避光存储，防止荧光衰减。

安全防护：操作时需佩戴手套、护目镜，避免染料接触皮肤或吸入；废液按实验室危险废物处理，防止环境污染。

温馨提示：仅用于科研，不能用于人体实验！wyh

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